当牙冠发育即将完成时，牙根开始发育。首先是内釉上皮和外釉上皮在颈环处增生，向未来的根尖孔方向生长，这些增生的双层细胞称为上皮根鞘。上皮根鞘的内侧面包绕着牙乳头细胞，上皮根鞘的外面被牙囊包绕。被上皮根鞘包绕的牙乳头细胞也向根尖部增生，其与上皮根鞘相接触的细胞分化成成牙本质细胞，形成根部牙本质。上皮根鞘继续生长并向根尖孔处呈45°角弯曲，形成一个中间有孔的盘状结构，称为上皮隔。其中间的孔即未来的根尖孔。

在单根牙形成中，上皮根鞘的内层细胞诱导邻近的牙髓细胞，分化为成牙本质细胞进而形成牙本质。牙本质形成后，其表面的上皮根鞘发生断裂，使上皮根鞘与根部牙本质分离，并向牙囊的深层移动，断裂的上皮根鞘呈网状包绕在牙根的周围。此时牙囊中的间充质细胞立即进入断裂的上皮细胞之间，并与牙根部牙本质接触，在该处分化成成牙骨质细胞，并分泌牙骨质基质，经矿化后形成牙骨质。而断裂的上皮根鞘细胞进一步离开根面，大部分被吸收，部分可遗留在发育中的牙周膜中，称上皮剩余，也称马拉瑟上皮剩余（Malassez epithelial rest）。此上皮遇刺激可形成牙源性囊肿或牙源性肿瘤。

多根牙的形成是由上皮隔的发育所决定的。首先在上皮隔上长出两个或三个舌状突起，然后增生伸长，与对侧突起相连，此时上皮隔中央的单个孔被分隔成两个或三个孔，将形成双根或三根。发育过程同单根牙。

在牙根发育过程中，如上皮根鞘的连续性受到破坏，或在根分歧处上皮隔的舌侧突起融合不全，则不能在该处诱导出成牙本质细胞，引起该处牙本质的缺损，牙髓和牙周膜直接相通，即侧支根管。如上皮根鞘在牙本质形成后仍不断裂并附着在牙根部牙本质表面，则牙囊的间充质细胞不能与根部牙本质接触，也就不能分化出成牙骨质细胞，这样在牙根表面形成牙骨质缺乏，易引起牙本质过敏。