酶标仪在用单波长测定吸光度时，除受到测定内源性干扰（包括噪音、漂移、电压等）因素外，受液体表面张力的影响也很大。在检测过程中，由于液面表面张力的作用，液体的表面不是一个平面，而是形成一个凹面，从侧面看似凹透镜，这样不可避免会影响光路的正常通过。由于凹液面的影响，光线在通过液面时，除正常的被液体吸收一部分外，尚有部分被折射和反射（如光线通过凹透镜那样），影响吸光度的检测。而酶标仪使用的又是通过光导纤维传播的点光源，如果每次能在同一部位检测，吸光度的重复性将得到保证，但由于机械运动等造成的误差，不可能保证每孔都在相同部分被检测，因此造成了孔与孔之间有一定的差异。

在双波长测定中，减少了测定干扰和电路干扰，因此测定结果明显好转。由于液体表面张力的不同，导致单波长测定时误差较大。并且用不同的洗涤剂会影响到最后加入底物和终止液后的液面情况，医学教育`网搜集整理用加入表面活性剂的洗涤剂清洗后，形成的液面更凹，对单波长检测的影响更大，并且与表面活性剂的浓度成正比。而用中性蒸馏水洗涤后，单、双波长检测技术结果基本一致。

在酶联免疫法测定抗原、抗体中，常用标记酶辣根过氧化物酶所使用的底物一般是邻苯二胺或四甲基联苯胺，显色终止后，二者在630nm和655nm处的吸光度值都只在吸收峰处（492nm/450nm）吸光度值的1%以下，因此，利用双波长检测，不会影响检测的灵敏度。建议在进行酶联免疫检测时，酶标仪比色应该首先双波长。这样可以提高临界值处标本的分析准度，减少实验误差。