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2011年医学检验资格考试辅导:电泳技术的现状和发展

www.zige365.com 2011-5-16 15:21:55 点击:发送给好友 和学友门交流一下 收藏到我的会员中心

三、电泳技术进行同工酶谱分析,提高诊断率

1、血清乳酸脱氢酶同工酶(iso-LDH):测定LDH同工酶有电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制剂法和酶切法,但迄今用得取多的仍是琼脂糖凝胶电泳法。经电泳分离后要分离出五种同工酶区带,急性必肌梗塞发病后平均6hLDH1即开始升高,LDH1/LDH2≥1为心肌损伤的阳性决定性水平,肝癌时可见LDH5明显升高,各区带含量的确定,将经电泳分离后的同工酶谱采用扫描予以定量,其精确度明显高于用肉眼判断。

2、血清肌酸激酶同工酶(ISO-CK);测定CK和CH-MB仍是目前用于证实急性心肌梗塞的道选指标。近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK=MB,其原理为抗M亚单位的酶活性,因为正常血清中几乎无CK=BB,故将此值乘以2可以认为大致代表CK-MB的活性。此法简单迅速,缺点是特异性差,如患者血清中存在CK-BB或者异常CK时,都将出现假性增高。不少作者报道异常CD-同工酶,一条称巨CK(Maxro-CK),它是CK-BB与免疫球蛋白的复合物,有IgG亦有IgA,在正常血清中Marco-CK仅占0.8%-1.6%.另一条称线粒体CK(CK-MT),CK-MT是结合在肌肉、脑、肝内的线粒体表面,可能是线粒体膜的碎片,在正常血清中CK-MT是不出现的,在心梗时亦不出现,只有当组织极度损伤,由于线粒体和细胞壁极度破坏,方可在血清中检出。由于Macro-CK和不典型的CK-MT均不能被M抗体所抑制,故当它们出现时,会导致CK-MB高于CK总活力的假性升高。使用电泳方法分离CK-MB,是根据CK-同工酶分子结构不同,在电泳缓冲液中,所带电荷各异,可以从阴极到阳极将CK不同组份予以分离,其分别为CK-MM,CK-MB和CK-BB.电泳特点是当出现异常2同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等,从电泳图谱上很容易发现,由扫描仪对各条酶进行扫描,报告各条区带所占百分比,结合总酶活力,求得区带的酶省略定值结果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中间,而CK-MT位置靠近阴极端,在CK-MM后面。这样不会将CK-BB和各种异常同工酶误认为是CK-MB而误诊,也可解决CK-MB假性增高的错误原因所在。为此,CK同工酶电泳是项非常实用的检验技术,具有十分重要的临床意义。

3、CK亚型同工酶:此外,CK-MB和CK-MM亚型测定常采用琼脂糖凝胶等电聚焦电泳或高压电泳,由于操作比一般电泳麻烦,故常规常测定尚无法普及。目前引进的自动电泳仪,有试剂盒提供,可作CK亚型分析,参考值:CK-MM1(57.7±4.7)%;CK-MM2为(26.5±5.3);CK-MM3为(15.8±2.5)%;CK-MM3/CK-MM1比值为0.28±0.05(范围0.15-0.39),阳性决定性水平》0.5.AMI第一天血中以MM3为主,但第二天以后则以MM1为主。采用电泳法分离CKMB,CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2极微,一般比值近似是而非,在急性心肌梗塞后4-6hCKMB2亚型即在血循环中可被检测到,故MB2/MB1的比例明显升高,并早于总CK-MB片段的增高。当心肌梗塞缓解后此比便也逐渐下降。也可用于溶栓治疗后的病情观察。

四、结合酶免疫标记抗体技术,检测脑脊液内寡克隆区带

曾有作者报道采用二维电泳和银染进行CSF蛋白质的分离与鉴定,方法繁复,耗时,现采用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离CSF中的蛋白质,并经抗原和辣根过氧化物酶标记的特异性IgG抗体进行反应来鉴定“寡克隆区带”(OCB),经此酶免疫标记放大技术和显色步骤,蛋白质浓度达31-125ul/L即可予以检测,可使检测灵敏度提高了100倍,这样脑脊液无须浓缩,避免了在浓缩过程中蛋白质的丢失。可用于证实和分辨OCB免疫球蛋白及其型别。若在脑脊液标本中检出OCB,而其相应标本中未能检出区带,则为阳性,真实地反映是由中枢神经系统本身合成的免疫球蛋白,具有重要临床意义。它是一种定性检测,在多发性硬化症时,OCB是一个十分重要的标志物。但须将患者血清和CSF在同一天同步进行分析,以认证不同来源的免疫球蛋白。中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号,主要用于诊断的鉴别诊断中枢神经系统疾患如:多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、付肿瘤性脑炎、神经性梅素等。

五、利用固相内抗原、抗体反应分离脂蛋白(a),用于心、脑知管独立的危险因子的检测

该技术是利用抗原、抗体反应将电泳分离的脂蛋白予以鉴别。血清经琼脂糖凝胶电泳,再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。由于凝胶中脂蛋白等电点不同,不仅可区分a、前β和β区带,又因介质中含有抗脂蛋白(a)【LP(a)】抗体及阳离子存在,抗LP(a)与患者血清中LP(a)结合形成复合物,阳离子则抑制其他脂蛋白的泳动速度,LP(a)便与其他脂蛋白分离开来,使分辨十分清晰的LP(a)条带呈现在前β与γ区域之间,将阳性条带扫描后,可获得区带的面积及其百分含量,该方法使电泳技术趋于完美,大大减少了手工操作的弊端,既可予以半定量,又能将胶片保存,便于比较。提高对心、脑血管独立的危险因子——LP(a)检测的敏感性和特异性。

六、按分子量大小进行非浓缩尿蛋白电泳,区分尿蛋白类型

尿蛋白电泳可将尿液中各种蛋白质分离用于区分尿蛋白类型,可在无操作的情况下,协助临床判断肾脏损伤的部位。国内部分实验室采用SDS-PAGE盘状电泳进行尿蛋白分离,该法具有局限性,耗时,操作繁琐,标本要求高,尿液需预浓缩,不适于临床实验室广泛开展。SDS=AGE电泳不需预浓缩,尿蛋白电泳后呈现出中、高分子量蛋白区,带主要反应肾小球病变;呈现出低分子量蛋白区带,可见于肾小管病变及溢出性蛋白尿;混合性蛋白尿则可见到大、中、小各种分子量区带,示肾小球及肾小管均受累及。扫描仪可对电泳后尿液中蛋白质剖象进行扫描,求出百分比,以显示肾小球或肾小管损伤程度,其电泳图谱及扫描图形可作国资料永载,利于分析比较。该技术的最大进步是尿液不需预浓缩,操作简便,结果清晰,仅需三小时即可完成试验,还备有完整的定性标准,易于量化,便于分析,对肾脏疾的诊断,鉴别诊断,指导治疗和判断愈合颇有价值。

近期发展起来的毛细管电泳是一种新型的区带电泳,又称毛细管带电泳。它是在毛细管中装入缓冲液,在其一端注入样品,在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离,他离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。毛细管电泳在检验医学中的应用也十分广泛,从所检测样品的来源看可分为尿样、血浆、血清、脑脊液、红细胞、其他体液或组织,以及实验动物活体等。从分离对象看包括蛋白质、多肽、氨基酸、糖、酶、DNA、寡核苷酸、病毒、小和生物活性分子、离子、药物及其代谢产物等。根据用途可分为临床疾病诊断、临床蛋白质分析、临床药物分析、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。由于它具有无法比拟的高效和快速性,因而受到越来越多科学家们的重视。

中国的电泳技术起步不算太晚,但由于种种原因,大多数实验室仍采用较落后的电泳设备。随着国际、国内科技发展的日新月异和检验医学发展的突飞猛进,电泳技术也在不断发展和更新,其在临床医学和分子生物学领域中有着极其广泛的应用价值,相信随着该技术的不断发展必将越来越受到同道们的青睐。

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