厌氧菌的分离培养主要分初代培养和次代培养两个阶段，其中初代培养相对比较困难，关键的问题就是厌氧环境和培养基的选择。
初代培养的一般原则是：
（1）先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择。
（2）尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基。
（3）最好多选1～2种覆盖面不同的选择性培养基。
（4）尽量保证培养基新鲜。
（5）要考虑到微需氧菌存在的可能。
1.选用适当的培养基接种：应接种固体和液体两种培养基；
（1）培养基的使用，应注意下列各点：
1）尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完；
2）应使用预还原培养基，预还原24～48h更好；
3）可采用预还原灭菌法制作的培养基（用前于培养基中加入还原剂，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等，尽可能使预还原剂处于还原状态）；
4）液体培养基应煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种；
5）培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子（血清、维生素K、氯化血红素、聚山梨酯-80等）。
（2）培养基的选择：初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。
1）非选择培养基：本培养基使分离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出所有的厌氧菌。常使用心脑浸液琼脂（BHI）、布氏琼脂（BR）、胰豆胨肝粉琼脂（GAM）、胰胨酵母琼脂（EG）、CDC厌氧血琼脂等。
2）选择培养基：为有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。
2.每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10à2环境中培养，以便正确地培养出病原菌，从而判断其为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌或厌氧菌中的哪一类。
3.厌氧培养法
（1）厌氧罐培养法。
（2）气袋法。
（3）气体喷射法：又称转管法。
（4）厌氧手套箱培养法：是迄今厌氧菌培养的最佳仪器之一。
（5）其他培养法：平板焦性没食子酸法；生物耗氧法；高层琼脂培养法。
4.厌氧状态的指示：美蓝和刃天青。无氧时均呈白色，有氧时美蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。
5.分离培养厌氧菌失败的原因：①培养前未直接涂片和染色镜检；②标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长；③未用新鲜配制的培养基；④未用选择培养基；⑤培养基未加必要的补充物质；⑥初代培养应用了硫乙醇酸钠作为唯一厌氧菌培养基；⑦无合适的厌氧罐或厌氧装置漏气；⑧催化剂失活；⑨培养时间不足；⑩厌氧菌的鉴定材料有问题。
